La nutrizione degli alveari interviene sulla genetica delle api: confronto fra alimentazione naturale ,saccarosio o sciroppo ad alto contenuto di fruttosio

Il forte declino delle popolazioni di api mellifere ha reso indispensabile comprendere i fattori chiave che incidono sulla salute delle api mellifere. Di grande preoccupazione è la nutrizione, poiché la malnutrizione nelle api da miele è associata a compromissione del sistema immunitario e aumento della suscettibilità ai pesticidi. Gli apicoltori alimentano spesso sciroppo di mais ad alto contenuto di fruttosio (HFCS) o saccarosio dopo la raccolta del miele o durante i periodi di carenza di nettare. Segnaliamo che, rispetto al miele, l’alimentazione cronica di una di queste due fonti alternative di carboidrati ha provocato centinaia di differenze nell’espressione genica nel corpo grasso, un tessuto periferico sensibile ai nutrienti analogo al fegato vertebrato e ai tessuti adiposi. Queste differenze di espressione includevano geni coinvolti nel metabolismo proteico e nella riduzione dell’ossidazione, inclusi alcuni coinvolti nel metabolismo della tirosina e della fenilalanina. Le differenze tra diete HFCS e saccarosio erano molto più sottili e includevano alcuni geni coinvolti nel metabolismo dei carboidrati e dei lipidi. I nostri risultati suggeriscono che le api ricevono componenti nutrizionali dal miele che non sono forniti da fonti alimentari alternative ampiamente utilizzate in apicoltura.

Le api da miele sono membri vitali degli ecosistemi naturali e agricoli di tutto il mondo. Negli Stati Uniti, l’ape occidentale del miele ( Apis mellifera ) contribuisce annualmente all’industria agricola per oltre 15 miliardi di dollari 1 . È quindi seriamente preoccupante che le popolazioni di api da miele siano costantemente diminuite negli Stati Uniti, con drammatiche perdite di colonie a partire dal 2006 associate al disturbo da collasso della colonia (CCD) 2 3 4 . Queste perdite hanno intensificato la necessità di comprendere i fattori che incidono sulla salute delle api da miele.

Al centro della salute delle api da miele è la nutrizione 5 . La malnutrizione nelle colonie di api da miele può derivare dal mantenimento di densità di colonie troppo alte per la flora disponibile o il posizionamento di colonie per l’impollinazione di colture carenti di polline o nettare o con un basso valore nutritivo 5 6 . Una cattiva alimentazione può rendere le api più sensibili ai pesticidi 7 e portare a un sistema immunitario compromesso che rende le api più vulnerabili alle malattie 8 .

La principale fonte naturale di carboidrati delle api da miele è il nettare, che viene raccolto dai fiori, trasportato all’alveare e convertito in miele per la conservazione. Questa conversione comporta la riduzione del contenuto d’acqua al 16-20% e l’aggiunta di secrezioni ghiandolari che contengono microrganismi ed enzimi, tra cui amilasi, glucosio ossidasi e invertasi 5 9 . Questi aumentano l’acidità e convertono il saccarosio nel nettare in glucosio e fruttosio 9 . I componenti finali del miele variano a seconda della fonte di nettare ma sono principalmente fruttosio (30–45%), glucosio (24–40%) e saccarosio (0,1–4,8%), nonché tracce di altri disaccaridi, vitamine, minerali , aminoacidi e vari composti fenolici 10 .

Le api da miele adulte usano il miele come combustibile per voli ad alta intensità energetica e termoregolazione delle colonie 9 . A differenza delle larve, gli adulti hanno bassi livelli di lipidi addominali e non possono sopravvivere per lunghi periodi senza una fonte di carboidrati. Una fornitura continua di zucchero è particolarmente importante per il foraggiamento delle api da miele, poiché hanno una dieta principalmente a base di carboidrati 11 . Rispetto alle api più giovani specializzate nell’esecuzione di compiti all’interno dell’alveare, i foraggiatori hanno anche un tasso metabolico più elevato 12 e perdono oltre la metà delle loro riserve lipidiche addominali prima di iniziare il foraggio 13 .

Gli apicoltori spesso forniscono carboidrati supplementari sotto forma di sciroppo di mais ad alto contenuto di fruttosio (HFCS) o saccarosio dopo la raccolta del miele o durante i periodi di carenza di nettare. L’integrazione con HFCS è diventata una pratica diffusa a seguito di primi studi che hanno mostrato una sopravvivenza accettabile delle api da miele 14 e una produzione di miele equivalente e una produttività a lungo termine rispetto all’alimentazione del miele 15 . Inoltre, l’HFCS ha un rapporto fruttosio-glucosio simile al miele, con la formulazione più comune per l’alimentazione delle api composta da 55% di fruttosio e 42% di glucosio 16 . L’HFC è anche meno costoso del saccarosio ed è meno dispendioso in termini di manodopera da somministrare come alimento perché si presenta in forma liquida 17 .

Tuttavia, sono sorte domande sull’idoneità dell’HFCS per le api da miele, in parte a causa del CCD e delle ricerche che mostrano che l’HFCS può avere effetti metabolici deleteri nei mammiferi 18 . Il miele artificiale prodotto esclusivamente da HFCS ha un profilo di carboidrati diverso (contiene fruttosil-fruttosio) rispetto al miele artificiale prodotto da saccarosio 19 e ha dimostrato di ridurre la covata primaverile e la produzione di cera rispetto al saccarosio 20 . Inoltre, vi sono prove crescenti che i componenti del miele naturale, assenti da saccarosio e HFC, influenzano positivamente il sistema di disintossicazione xenobiotica dell’ape 21 22 . Questi risultati suggeriscono che miele, saccarosio e HFC possono avere un impatto diverso sulla fisiologia e sulla salute delle api da miele.

Abbiamo esplorato ulteriormente questo problema con la trascrittomica dell’intero genoma per esaminare in modo completo gli effetti di miele, saccarosio e HFC sull’espressione genica del grasso corporeo. Il corpo grasso è un organo multifunzionale responsabile della conservazione dei nutrienti, della mobilitazione energetica e della produzione di peptidi antimicrobici. Lo stoccaggio e la mobilizzazione dei nutrienti sono associati a segnali ormonali che includono insulina e ormone adipocinetico per soddisfare le esigenze fisiologiche in corso 23 . Nelle api da miele adulte, il corpo grasso è noto per essere trascrizionale rispondente alle manipolazioni nutrizionali e alle manipolazioni che incidono sull’invecchiamento e sulla salute 24 25 . Ci siamo concentrati sul corpo grasso per studiare gli effetti di diverse fonti di carboidrati alimentari sull’espressione di geni coinvolti nella segnalazione ormonale, nella conservazione dei nutrienti, nel metabolismo energetico e nella funzione immunitaria. In questo studio, abbiamo usato api più vecchie (18-21 giorni) perché la loro dieta è principalmente a base di carboidrati 11 e perché le api più anziane hanno dimostrato di essere i principali consumatori di integratori di carboidrati all’interno dell’alveare 5 .Go to:

risultati

Le misurazioni effettuate quotidianamente durante gli studi di una settimana hanno mostrato livelli simili di consumo di cibo per le api alimentate con miele, HFC o saccarosio (0,040 ± 0,001, 0,036 ± 0,002, 0,032 ± 0,003 g / ape / giorno, rispettivamente, F = 4,26 P = 0,055) . Anche la mortalità non variava tra le diete (F = 0,57 P = 0,59) ed era compresa tra lo 0 e il 7% in tutte le gabbie.

Il sequenziamento dell’RNA (RNA-seq) è stato eseguito per esaminare l’effetto di ciascun trattamento dietetico sull’espressione genica del grasso corporeo. In totale, sono stati sequenziati 5 pool di campioni per trattamento dietetico e repliche di colonie (N = 10). L’esame iniziale dei nostri risultati ha rivelato che uno dei nostri replicati di colonie era pesantemente infetto dal virus dell’ala deformata (DWV). Per la Colonia A, una media di 37,06 ± 8,66% legge allineata alla sequenza del genoma DWV rispetto a solo 1,29 ± 2,77% per la Colonia B. Al contrario, una media del 53,81 ± 0,08% delle letture di RNA-seq mappate sull’ape del miele genoma per la Colonia A, mentre per la Colonia B la media era dell’87,72 ± 0,03%. A causa di questa differenza, abbiamo analizzato ciascuna colonia separatamente. Abbiamo esplorato gli effetti del trattamento dietetico usando i diagrammi di ridimensionamento multidimensionale (MDS) (usando il cambio del log log dei primi 100 geni) generato per ogni colonia. Queste analisi hanno indicato che l’alimentazione cronica di saccarosio e HFC ha suscitato profili trascrittomici distinti dalle api alimentate con una dieta a base di miele ( Figura S1A e S1B ). Questo modello è stato osservato per entrambe le colonie, indicando risposte transcriptomiche simili a trattamenti dietetici verificatisi indipendentemente dalle differenze nella carica virale apparente.

Per sondare più ampiamente gli effetti della dieta sull’espressione genica, abbiamo analizzato insieme i risultati di entrambe le colonie, valutando l’effetto principale del trattamento dietetico con la colonia come fattore bloccante. Il miele ha suscitato centinaia di differenze nell’espressione genica rispetto a HFCS e saccarosio ( Figura 1A ). Esistono 104 geni espressi in modo differenziato (FDR <0,1) in api alimentate con miele o HFC e 220 geni espressi in modo differenziato tra api alimentate con miele o saccarosio. Al contrario, le differenze tra diete HFCS e saccarosio erano molto più limitate con un totale di 8 geni espressi in modo differenziato tra questi due gruppi. Confronti genetici mostrano una sostanziale sovrapposizione (64 geni) tra miele e saccarosio (29,1% sovrapposti) e miele vs HFCS (61,5% di geni sovrapposti) che indicano forti somiglianze tra questi elenchi di geni ( Figura 1B ).

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Figura 1
Differenze nell’espressione genica nel grasso corporeo delle api causate da diete a base di miele, saccarosio o sciroppo di mais ad alto contenuto di fruttosio (HFCS).(A) Numero di geni espressi in modo differenziato (DEG) per ciascun confronto dietetico (FDR <0,1). (B) Numero di DEG che si sovrappongono tra i confronti dietetici. (C) Le categorie di Ontologia genica si sono notevolmente arricchite ( P <0,004) per ogni confronto dietetico.

Le analisi di predizione di classe utilizzando l’algoritmo 26 di supporto vettoriale hanno rivelato che i cambiamenti nell’espressione genica del grasso corporeo indotti dalla dieta erano robusti e coerenti tra i campioni. L’adesione alla classe è stata prevista correttamente con un’accuratezza del 96% (Miele vs. Saccarosio), 97,5% (Miele vs. HFCS) e 100% (HFCS vs. Saccarosio), corrispondente a valori di sensibilità (veri positivi identificati) tra 0,92–1 e valori di specificità (veri negativi identificati) di 0,95–1. I principali predittori per ciascun confronto dietetico sono mostrati nella Figura S2 . Notevoli tra i principali geni predittori per i confronti a base di miele sono stati il glutatione S transferasi O3 (GB44803) e pallido (GB40967), che sono associati rispettivamente alla disintossicazione xenobiotica e al metabolismo della tirosina . Maltase B1 (GB54549) e altri due geni coinvolti nel metabolismo energetico, GB50596 (termine GO: attività ossido-reduttasi) e GB48029 (termine GO: attività del trasportatore acil carnitina), sono stati i principali predittori per il confronto HFCS vs Saccarosio.

Coerentemente con le analisi di previsione di classe, le analisi di arricchimento di Gene Ontology (GO) hanno mostrato che gli elenchi di geni sovraregolati dal miele sono stati arricchiti per i geni coinvolti nel metabolismo degli aminoacidi e nella riduzione dell’ossidazione ( Figura 1C , Tabella S1 ), in particolare il metabolismo della fenilalanina e della tirosina. Questi includevano pallido, henné (GB48022) e omogentisate 1,2-diossigenasi (GB53288). Rispetto al saccarosio, il miele ha anche sovraregolato il gene flavin monooxygenase 1 (GB42239), associato alla riduzione dell’ossidazione e alla disintossicazione da alcaloidi 27 . Al contrario, i geni sovraregolati di saccarosio associati con assonogenesi, trasporto anionico e diversi fattori di trascrizione associati allo sviluppo di organi, come doublesex (GB55036) , nodo (GB42304) e tolkin (GB52106), mentre HFCS sovraregolavano i recettori transmembrana, senza domino ( GB42244) e recettore della tiramina (GB47385) ( Figura 1C , Tabella S1 ). Nessun termine GO è stato arricchito per gli 8 geni espressi in modo differenziato tra api alimentate con HFCS e saccarosio.

Per ottenere ulteriori approfondimenti sul significato biologico di queste differenze indotte dalla dieta nell’espressione genica del grasso corporeo, abbiamo confrontato i nostri risultati con tre esperimenti trascrittomici (microarray) precedentemente pubblicati sugli aspetti nutrizionali della maturazione comportamentale nelle api da miele 24 . La maturazione comportamentale nelle api da miele comporta un passaggio da una dieta ricca di proteine ​​a una dieta ricca di carboidrati e una perdita di circa il 50% dei lipidi corporei grassi 13 prima del passaggio dal lavoro nell’alveare al foraggiamento. Questo spostamento comportamentale e fisiologico include anche una riduzione dei titoli ematici della vitamina Vitellogenin (Vg) di conservazione dei lipidi 28 che è stata associata alla promozione della longevità delle api da miele 29 e dell’immunità 30 . Abbiamo confrontato i nostri risultati con tre esperimenti di microarray: 1) Maturazione (api alveare rispetto ai forager); 2) vg knockdown ( vg RNAi rispetto al controllo); e 3) Dieta [le api hanno nutrito una dieta ricca di proteine ​​(45% polline, 45% miele, 10% acqua) rispetto al saccarosio (50% p / v)]. Abbiamo rilevato una significativa sovrapposizione tra i cambiamenti precedentemente riportati nell’espressione genica del grasso corporeo che si verificano durante l’alveare alla transizione foraggera 24 e le nostre attuali liste dei geni Honey vs. Sucrose e Honey vs. HFCS ( Tabella 1 ). Sorprendentemente, il profilo di espressione genica del grasso corporeo delle api dell’alveare arricchite dal punto di vista nutrizionale era più simile a quello delle api alimentate con saccarosio, mentre il profilo delle foraggere più prive di nutrimento era più simile a quello delle api alimentate con miele ( Tabella 1 ) . Le analisi di arricchimento del GO hanno mostrato che il sottoinsieme di geni sovrapposti alle diete Honey vs. Sucrose o Honey vs. HFCS e l’esperimento relativo alla maturazione erano associati al metabolismo proteico e alla riduzione dell’ossidazione ( Tabella S2 ). C’è stata anche una significativa sovrapposizione tra l’elenco dei geni Honey vs. Sucrose e Honey vs. HFCS e l’elenco dei geni dell’esperimento vg RNAi 24 ; tuttavia, le variazioni del log fold per i geni sovrapposti non erano significativamente correlate, indicando che le liste dei geni non erano direzionalmente simili ( Tabella 1 ). Non ci sono state significative sovrapposizioni tra i nostri elenchi di geni Honey vs. Sucrose e Honey vs. HFCS e l’esperimento Diet 24 , ma i geni che si sono sovrapposti hanno mostrato una correlazione positiva significativa secondo la quale gli effetti del miele erano direzionalmente concordanti con quelli del trattamento Pollen + Honey ( Tabella 1 ).

Discussione

Una dieta a base di miele ha suscitato un profilo trascrizionale distinto dalle diete di saccarosio e HFCS. Queste differenze erano presenti in due diverse colonie di api, con cariche virali molto diverse, indicando che l’impatto del miele sull’espressione genica del grasso corporeo è robusto. Questi risultati suggeriscono che i componenti del miele regolano in modo differenziato i processi fisiologici e che il saccarosio e l’HFC possono non essere sostituti nutrizionali equivalenti al miele.

Le analisi di arricchimento di Gene Ontology hanno mostrato che il miele sovraregola i geni associati a processi come il “processo metabolico della famiglia di aminoacidi aromatici” e la “riduzione dell’ossidazione”. al metabolismo della fenilalanina e della tirosina. Questi aminoacidi sono stati collegati alla produzione di neurotrasmettitori 31 e nel caso di risposte da pallide a immuni all’infezione 32 . Il miele ha inoltre sovraregolato il gene glutatione S transferasi O3, la cui attività è nota per essere indotta da composti vegetali e avere un significato tossicologico in presenza di pesticidi 33 . Gli HFC e il saccarosio rispetto al miele hanno determinato la sovraregolazione di diversi processi biologici. Il saccarosio, ad esempio, processi sovraregolati come l’assonogenesi, ma è improbabile che l’assonogenesi sia sovraregolata nei nostri campioni di grasso corporeo; piuttosto questa categoria GO riflette la sovraregolazione dei percorsi di segnalazione che svolgono ruoli diversi nei diversi tessuti. L’HFCS ha sovraregolato i recettori transmembrana senza cupola e il recettore della tiramina suggerendo differenze nella segnalazione JAK-STAT e nella segnalazione della tirosina tra HFCS e miele.

Saccarosio e HFC hanno suscitato una risposta trascrizionale del corpo grasso notevolmente simile. Questo risultato è coerente con studi precedenti che non mostravano differenze nella produttività delle colonie a causa di queste diete 15 ma contrasta con i risultati che mostrano differenze nella produzione di cera e nella sopravvivenza delle api da miele a causa del saccarosio o dell’HFC 14 20 . I nostri risultati suggeriscono che le api più anziane potrebbero non essere sensibili all’aumento del consumo di fruttosio perché abbiamo rilevato poche prove che riflettono i tipi di cambiamenti nella segnalazione ormonale, nel metabolismo energetico e nella conservazione dei nutrienti associati allo sciroppo di mais ad alto fruttosio e all’aumento del consumo di fruttosio nei mammiferi 18 34 . La ricerca futura dovrebbe verificare se si osservano maggiori differenze nell’espressione genica dovute al saccarosio o all’alimentazione di HFC nelle api giovani o di mezza età, che svolgono rispettivamente attività di allevamento della covata e di pettinatura, o se le poche differenze nell’espressione genica osservate in questo esperimento possono spiegare per differenze nelle prestazioni delle colonie in condizioni più naturali.

Per capire se le differenze di espressione genica associate a una dieta a base di miele si riferiscono a cambiamenti fisiologici correlati alla maturazione, abbiamo confrontato i nostri risultati con studi di microarray di grasso corporeo pubblicati in precedenza 24 . Questi confronti hanno mostrato un significativo arricchimento tra elenchi di geni a base di miele e geni espressi in modo differenziato tra api alveare e foraggeri, nonché con differenze di espressione genica associate al trattamento con vitellogenina RNAi. Le analisi funzionali suggeriscono che i cambiamenti condivisi nell’espressione genica erano correlati al metabolismo proteico e alla riduzione dell’ossidazione, suggerendo che questi processi rispondono alle manipolazioni dirette della dieta e ai cambiamenti della maturazione. Contrariamente alle nostre aspettative, abbiamo scoperto che il profilo trascrizionale delle api alimentate con il miele assomigliava ai foraggeri meno nutriti piuttosto che alle api nutrici più nutrite. Questi risultati suggeriscono che potrebbero esserci composti nel miele che modulano la fisiologia delle api da miele verso uno stato simile a un foraggiatore.

Non abbiamo trovato significative sovrapposizioni tra il nostro elenco di geni espressi in modo differenziato Honey vs Sugar e l’elenco precedentemente pubblicato di api che hanno ricevuto una dieta a base di polline + miele o saccarosio. Questo risultato è sorprendente perché il precedente contrasto era incorporato in questo esperimento di microarray legato all’alimentazione. Ciò indica che il polline è in gran parte responsabile dei cambiamenti di espressione genica nell’esperimento di microarray dietetici e che tali cambiamenti sono separati da quelli suscitati dal miele nel nostro esperimento. La mancanza di arricchimento statistico con cambiamenti indotti dal polline riflette parzialmente il livello relativamente basso di proteine ​​nel miele. Oltre all’uso di diverse piattaforme sperimentali (RNA-seq vs. microarray), c’erano anche differenze nell’età delle api testate in ciascun esperimento: l’esperimento di microarray relativo all’alimentazione ha studiato l’effetto del trattamento dietetico sulle api più giovani in grado di digerire il polline, mentre il nostro esperimento ha testato le api più vecchie con una ridotta capacità di digerire il polline. Pertanto, le differenze trascrizionali suscitate da una dieta a base di miele non possono essere direttamente attribuite a tracce di polline nel miele.

Il nostro obiettivo era quello di eseguire un ampio sondaggio imparziale per gli effetti del miele, del saccarosio e dell’HFC sulla fisiologia delle api da miele. Il nostro risultato è che il miele – ma non il saccarosio o HFC – sovraregola i geni associati al metabolismo proteico e alla riduzione dell’ossidazione è indicativo del fatto che il miele susciti differenze fisiologiche legate alla salute. Abbiamo eseguito il nostro esperimento utilizzando api più vecchie che in genere consumano soluzioni di zucchero all’interno dell’alveare e non digeriscono il polline; pertanto, i componenti del miele possono fornire componenti nutrizionali e induttori critici che altrimenti sarebbero assenti in questa fascia di età. Precedenti ricerche hanno già identificato i componenti del miele che sovraregolano i percorsi di disintossicazione nell’intestino 22 ; i nostri risultati mostrano inoltre che il miele induce cambiamenti nell’espressione genica su scala più globale. Questi cambiamenti possono avere rilevanza tossicologica in condizioni naturali negli agroecosistemi contemporanei, dove le api sono regolarmente esposte a tossine e pesticidi.

metodi

api

Abbiamo usato le api delle colonie di api del miele presso l’University of Illinois Bee Research Facility, Urbana, IL, mantenute secondo le normali pratiche di apicoltura. Le api erano una miscela di sottospecie europee tipiche di questa regione. Per minimizzare la variazione genetica all’interno di un replicato, abbiamo usato api operaie adulte di una colonia derivata da una regina inseminata da un singolo maschio; a causa dell’aplodiploidia, queste api erano correlate tra loro da un coefficiente medio di correlazione di 0,75. L’esperimento è stato replicato in due prove indipendenti, ogni volta usando api di colonie diverse, non correlate.

Prove di alimentazione

Abbiamo usato api adulte di età compresa tra 18-21 giorni. Queste sono api più vecchie che consumano prontamente varie fonti di carboidrati nell’alveare 5 . Per ottenere le api focali abbiamo rimosso le cornici a nido d’ape contenenti pupe, le abbiamo posizionate in un’incubatrice (34 ° C / 30% RH), contrassegnate api di un giorno emerse di recente con una macchia di vernice (Testor’s Paint, Rockford, IL, USA) sulla superficie dorsale del torace e reintrodotto le api segnate nella loro colonia natale; questo è stato ripetuto tre giorni consecutivi per ottenere una popolazione base di> 500 api segnate nell’alveare. Le api focali sono state raccolte all’età di 18-21 giorni, collocate in gabbie di plexiglas (10 × 10 × 7 cm; 15 api per gabbia) e assegnate un trattamento dietetico in laboratorio. I trattamenti dietetici consistevano in 50% (p / v) di miele, 50% di sciroppo di mais ad alto contenuto di fruttosio (HFCS 55) o 50% di saccarosio ad libitum per ogni replicato di gabbia (N = 3 replicati di gabbia per trattamento). Tutte le gabbie sono state conservate in un incubatore a 29 ° C. Il consumo e la mortalità sono stati monitorati quotidianamente per 7 giorni. Dopo questo periodo di tempo, le api sono state congelate rapidamente e conservate a -80 ° C per analisi.

Dissezioni ed estrazioni di RNA

Le dissezioni sono state eseguite incubando ciascun addome in RNA refrigerato-successivamente ICE (Ambion) a -20 ° C per un minimo di 16 ore. L’intestino e il tessuto ventrale sono stati quindi rimossi ed è stata eseguita l’estrazione di RNA sul corpo grasso e sulla cuticola dorsale aderente (kit RNeasy, Qiagen, con un trattamento DNAse).

Costruzione della libreria cDNA e sequenziamento dell’RNA

Abbiamo costruito librerie di cDNA utilizzando RNA totale aggregato da tessuto adiposo di grasso corporeo proveniente da 3 singole api. Il pooling è stato eseguito per ridurre al minimo la variabilità del campione all’interno dei gruppi di trattamento. Ogni libreria di cDNA è stata preparata con 1,5 μg di RNA totale aggregato e costruita utilizzando il kit direzionale RNA-seq NEXTflex ™ (Bioo Scientific) con una fase di purificazione dell’mRNA aggiunta utilizzando Dynabeads® Oligo (dt) 25 (Invitrogen). Le concentrazioni delle librerie sono state quantificate utilizzando la quantificazione fluorometrica Qubit® e mediante PCR quantitativa in tempo reale utilizzando i kit Quant della libreria Kapa (KapaBiosystems). La dimensione media dei frammenti e la qualità complessiva sono state valutate con la piattaforma Bioanalyzer 2100 di Agilent e un kit di DNA ad alta sensibilità Agilent. Per il sequenziamento, tutte le librerie sono state diluite a una concentrazione di 6 nM. In totale, abbiamo sequenziato 5 librerie per trattamento per colonia, per un totale di 30 librerie. Dieci librerie sono state sequenziate per corsia (2-4 librerie per trattamento dietetico / per corsia) con uno strumento Illumina HiSeq2000 e sono state sequenziate come letture single-end, 100 nt.

Bioinformatica

Il sequenziamento dell’RNA ha generato una media di 19.200.920 letture per libreria. Le letture di ciascuna libreria sono state allineate rispetto al genoma di Apis mellifera , Assembly 4.5 35 usando Tophat 36 e i conteggi delle letture sono stati generati per i geni usando HTSeq v0.5pv2 ( http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq ) e il set ufficiale di geni Apis mellifera , versione 3.2. Le letture non mappate in modo univoco o mappate su posizioni genomiche esterne ai geni non sono state incluse nelle analisi per l’espressione differenziale. Abbiamo identificato geni espressi in modo differenziato (DEG) utilizzando un modello lineare generalizzato nel pacchetto EdgeR, versione 3.2.4 37 .

Poiché il numero di geni espressi in modo differenziato in questo studio era in centinaia anziché in migliaia, abbiamo eseguito un’ulteriore analisi per testare la solidità dei risultati. Abbiamo confrontato le differenze nell’espressione genica del grasso corporeo tra due sottogruppi dell’intero gruppo di individui nutriti con miele (n = 5 per sottogruppo), consentendo i campioni assegnati a ciascun sottogruppo per un totale di 100 volte. Abbiamo trovato solo pochi geni [2,07 ± 0,344 geni (FDR <0,1)] da esprimere in modo differenziale in questi confronti, suggerendo che le differenze che segnaliamo tra i trattamenti dietetici sono affidabili.

Identificazione di infezione da virus dell’ala deforme

Le letture non allineate al genoma di Apis mellifera sono state interrogate utilizzando BLAST sul sito Web dell’NCBI. I risultati di BLAST hanno identificato le letture non allineate della colonia A come sequenze di virus dell’ala deformata (DWV). Abbiamo ulteriormente convalidato l’infezione DWV allineando tutte le letture di ciascun campione al genoma DWV ( ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Viruses/Deformed_wing_virus_uid14891 ), utilizzando Bowtie 2.

Analisi delle previsioni di classe

Per identificare i cambiamenti più robusti e coerenti nell’espressione genica del grasso corporeo causati da ciascuna dieta, abbiamo eseguito analisi di previsione di classe utilizzando l’algoritmo di supporto vettoriale con validazione incrociata 5 volte. Le analisi di predizione di classe sono state eseguite utilizzando CMA 26 , con conteggi di lettura normalizzati per geni con un valore P <0,05. I principali predittori per ciascun contrasto di dieta sono stati selezionati in base alla loro classifica come classificatore superiore in almeno 10 delle 50 iterazioni.

Analisi di ontologia genica

Inferenze per i principali temi funzionali per ciascun elenco DEG sono state tratte dalle analisi di arricchimento GO utilizzando lo strumento di annotazione funzionale DAVID Bioinformatic Resources 6.7 38 . Queste analisi sono state eseguite utilizzando gli ortologi Drosophila melanogaster associati a ciascun elenco DEG. Le analisi statistiche dell’arricchimento sono state eseguite con un test ipergeometrico, usando come riferimento il numero di geni delle api mellifere con ortesi di Drosophila con annotazioni.

Confronti con precedenti studi di microarray

Ament et al. (2011) hanno precedentemente pubblicato i risultati di esperimenti di microarray che studiano l’espressione genica del grasso corporeo in relazione agli aspetti nutrizionali della maturazione comportamentale. Abbiamo confrontato i nostri risultati con tre di questi: 1) Maturazione (api alveare rispetto ai forager; 2) abbattimento della vitellogenina ( vitellogenina dsRNA rispetto al controllo; e 3) Dieta: [le api hanno nutrito una dieta ricca di proteine ​​(45% polline, 45% miele, 10% di acqua) rispetto al saccarosio (50% p / v)].

Per determinare se gli elenchi di DEG contenevano livelli significativi di sovrapposizione, abbiamo calcolato un fattore di arricchimento (RF) dividendo il numero osservato di geni sovrapposti per il numero previsto. Il numero previsto di geni sovrapposti è stato calcolato moltiplicando la lunghezza di ciascun elenco DEG e quindi dividendo questo valore per il numero totale di geni inclusi nelle analisi 39 . Un valore RF maggiore di 1 indica che il numero osservato di geni sovrapposti è maggiore del valore atteso, dimostrando così un arricchimento. L’arricchimento significativo è stato determinato utilizzando un test ipergeotmetrico (1 coda) con la funzione p-iper in R. Per determinare se i geni sovrapposti tra due elenchi erano direzionalmente concorde nella direzione prevista, abbiamo confrontato le modifiche del log-fold per ciascun elenco di geni e valutato il significato con una correlazione di Pearson. Una correlazione di Pearson positiva e significativa mostra che la maggior parte dei geni sovrapposti tra due elenchi di geni mostra cambiamenti concordanti nell’espressione genica.Go to:

Contributi dell’autore

MMW e GER hanno progettato la ricerca; MMW ha svolto la ricerca e analizzato i dati; MMW e GER hanno scritto il manoscritto.Go to:

Materiale supplementare

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Ringraziamenti

Riconosciamo A. Cash per la sua esperienza con le tecniche molecolari e C. Nye per la sua assistenza nel settore. Ringraziamo anche MR Berenbaum, NL Naeger, S. Sinha e CW Whitfield per i suggerimenti utili che hanno migliorato questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del Centro integrato di gestione dei parassiti della regione centro-settentrionale a MMW e GERGo to:

Riferimenti

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Gli articoli dei rapporti scientifici sono forniti qui per gentile concessione di Nature Publishing Group

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