Un po di caffeina allunga la vita delle api e combatte il Nosema ceranae

Fitochimici dietetici, longevità delle api da miele e tolleranza ai patogeni

Elisa Bernklau , ¹Louis Bjostad , ¹Alison Hogeboom , ²Ashley Carlisle , ³ e Arathi HS^2,*Informazionisull’autore Note sull’articoloInformazionisul copyright e sulla licenzaDisclaimerQuesto articolo è stato citato da altri articoli in PMC.

Astratto

La continua perdita di habitat naturali costituiti da praterie autoctone e macchie di fiori selvatici sta riducendo le diverse fonti di polline, nettare e sostanze fitochimiche disponibili per le api bottinatrici. Abbiamo studiato gli effetti di quattro fitochimici: caffeina, acido gallico, kaempferolo e acido p- cumarico, sulla sopravvivenza e la tolleranza ai patogeni nell’ape europea, Apis mellifera (L.). 

Abbiamo registrato la longevità delle api operaie a cui è stato fornito ad libitum l’ accesso ad una soluzione di zucchero integrata con diverse concentrazioni di sostanze fitochimiche. Abbiamo infettato artificialmente le api operaie con il parassita protozoo, Nosema ceranae . Le api infette hanno avuto accesso alle stesse concentrazioni dei fitochimici nella soluzione di zucchero e sono state determinate la loro longevità rispetto al carico di spore e alla mortalità. Le api integrate con sostanze fitochimiche alimentari sono sopravvissute più a lungo e le concentrazioni più basse sono state generalmente più benefiche. I fitochimici dietetici hanno consentito alle api di combattere le infezioni a seguito del ridotto carico di spore e ridurre la mortalità. Molti dei fitochimici sono composti di difesa delle piante che gli impollinatori si sono evoluti per tollerare e trarre benefici. I nostri risultati supportano le basi chimiche delle interazioni coevolutive e ribadiscono l’importanza della diversità nelle fonti di nutrizione floreale per sostenere popolazioni di api da miele sane rafforzando le naturali relazioni mutualistiche.Parole chiave:Apis mellifera , api da miele, nettare, Nosema ceranae , fitochimici, interazioni pianta-impollinatore

1. Introduzione

Le recenti fluttuazioni osservate nelle popolazioni di api da miele sono state attribuite al degrado dell’habitat, all’agricoltura ad alta intensità chimica, ai parassiti e ai patogeni [ 1 ]. Anche se la domanda di servizi di impollinazione continua a crescere, gli impatti ecologici dell’agricoltura moderna, compresa l’eliminazione dei resti di praterie autoctone e macchie di fiori selvatici, stanno portando a un netto calo della diversità della dieta polline / nettare delle api, compromettendo la loro capacità di salute e fisiologiche [ 2 , 3 ]. Le api adulte hanno bisogno di un accesso continuo a carboidrati, proteine, lipidi e altri composti floreali per soddisfare le loro esigenze energetiche e i nutrienti nel polline e nel nettare svolgono un ruolo vitale nel soddisfare queste esigenze e migliorare la capacità delle api di far fronte allo stress.

Le relazioni tra le piante da fiore e i loro impollinatori hanno una lunga storia coevolutiva.  Le api da miele sono tra gli impollinatori più efficienti e il nettare floreale e il polline che raccolgono offrono un assortimento di proteine, lipidi, carboidrati e micronutrienti come vitamine e sostanze fitochimiche. Questi costituenti primari di nettare e polline sono essenziali per la nutrizione larvale e degli adulti. Mentre i macronutrienti derivati ​​da ricompense floreali svolgono un ruolo fondamentale nelle fasi della storia della vita delle api da miele, il ruolo dei fitochimici viene esplorato solo ora. Comprendere l’impatto dei fitochimici dietetici è necessario per migliorare la riproduzione, lo sviluppo e le attività di bottinatura nelle api da miele che apriranno la strada al mantenimento di colonie sane e popolazioni sostenibili. Un’alimentazione adeguata è essenziale per la normale crescita della colonia di api da miele. Le singole api con un’alimentazione adeguata ed equilibrata sono meglio attrezzate per resistere ai fattori di stress biotici e abiotici e contribuiscono efficacemente a migliorare la conservazione e le prestazioni degli alimenti delle colonie.

Le relazioni tra pianta e impollinatore attraverso l’obiettivo dell’ecologia chimica possono contenere risposte per stabilire popolazioni di api sane. La disponibilità e la diversità delle risorse floreali influenzano fortemente il loro valore nutrizionale, in particolare l’equilibrio di carboidrati, lipidi e proteine ​​e la disponibilità di sostanze chimiche secondarie vegetali (fitochimici) presenti nel nettare e nel polline. Una dieta adeguata non solo soddisfa le esigenze metaboliche degli individui, ma aumenta l’immunocompetenza e la resistenza ai patogeni e ai pesticidi. Mentre i carboidrati soddisfano le elevate esigenze metaboliche delle api adulte, i lipidi svolgono una moltitudine di funzioni tra cui dimorfismi fisiologici tra i gruppi di lavoro di operaie nelle api mellifere adulte e le proteine ​​guidano lo sviluppo e la crescita di larve e giovani operaie e migliorano la longevità. La ricerca attuale suggerisce che i fitochimici conferiscono benefici contro le infezioni, migliorando al contempo la capacità immunitaria e la tolleranza allo stress nelle api.

Sebbene l’evoluzione dei metaboliti secondari delle piante sia radicata nella difesa dagli erbivori, gli impollinatori sperimentano sia effetti dannosi che benefici da questi composti. Cumarine, flavonoli e alcaloidi che sono generalmente tossici, possono contrastare le infezioni patogene e migliorare la funzione fisiologica . Mentre gli effetti di sostanze fitochimiche come il timolo e l’eugenolo sono benefici, gli effetti di alcuni acidi fenolici, flavonoli, flavanoni e flavoni, sulla salute delle api non sono completamente compresi. I fitochimici, come il timolo, possono anche provocare reazioni avverse tra cui la perdita di fototassi ( fototassi : Movimento di organi od organismi biologici determinato da stimoli luminosi in modo tale da modificare la propria posizione rispetto allo stimolo stesso. ndt) e l’espressione della vitellogenina (larve). La persistenza dei mutualismi pianta-impollinatore non solo ribadisce il ruolo delle sostanze chimiche vegetali nel sostenere questa relazione, ma implica anche che i fitochimici sono probabilmente importanti. Comprendere questa relazione chimica tra api e piante potrebbe essere un passo fondamentale verso il discernimento della complessità della salute delle api influenzata dalle piante.

Il polline e il nettare nei fiori offrono una vasta gamma di sostanze chimiche. Alcuni di questi, tra cui acidi fenolici, flavonoli e alcaloidi, hanno dimostrato di essere utili per gli impollinatori. In un esperimento preliminare, abbiamo testato una varietà di sostanze fitochimiche per il loro effetto sulla longevità delle api operaie. Due dei composti che abbiamo testato (acidi fenolici tra cui acido caffeico e acido ferulico) non hanno avuto effetti significativi, mentre gli altri composti tra cui caffeina (alcaloide), acido gallico e acido p- cumarico (acidi fenolici) e kaempferol (flavonolo), hanno aumentato significativamente la longevità delle api operaie. Queste sostanze chimiche (incluso l’acido cumararico in cui è stato precedentemente dimostrato un aumento della longevità delle api operaie) sono state quindi scelte per ulteriori esperimenti nel presente studio. Il nostro obiettivo è stato quello di rivelare diverse classi di sostanze fitochimiche che sono benefiche per le api da miele. Le risposte che abbiamo misurato includono la sopravvivenza delle api operaie e la tolleranza all’infezione da Nosema ceranae quando le api hanno ricevuto un’integrazione dietetica con i quattro diversi fitochimici: caffeina, acido gallico, kaempferolo e acido p- cumarico.

2. Materiali e metodi

Sono stati condotti esperimenti a Fort Collins (CO, USA) con colonie di Apis mellifera . Per l’integrazione dietetica con sostanze fitochimiche, le api di corte di età conosciuta sono state ottenute usando la procedura standard di contenimento della regina. Alle regine delle colonie sperimentali venivano fornite cornici vuote e contrassegnate in modo univoco per deporre le uova. La regina è stata messa in gabbia in un telaio vuoto per 24 ore per garantire che tutte le uova sul telaio fossero deposte durante quella giornata. La data in cui la regina fu messa in gabbia fu segnata sul telaio. Tali cornici marcate contenenti pupe in fase avanzata sono state rimosse dalle colonie di origine dopo 21 giorni e poste in un’incubatrice a 32 ° C e umidità al 50% fino al giorno dell’emergenza. Gli individui adulti sono stati contrassegnati con il colore nel giorno dell’emergenza usando colori diversi per giorni diversi per indicare coorti di età unici. Le api contrassegnate sono state restituite alle colonie di origine, raccolte dopo otto giorni per i nostri saggi. Abbiamo scelto le api di otto giorni in quanto erano di mezza età e avevano una maggiore probabilità di essere api di casa rispetto alle api più anziane che erano in cerca di cibo. Questa età è adatta anche per l’infezione artificiale con spore di N. ceranae rispetto alle api appena emerse. Gli studi descritti di seguito sono stati condotti durante la stagione estiva (da maggio ad agosto) su tre colonie ciascuna per un periodo di due anni.

2.1. Saggio di sopravvivenza

Api di otto giorni sono state assegnate gabbie a tazza monouso in modo tale che vi fossero dieci api in ciascuna gabbia. Le api avevano accesso a piacere per nutrirsi dei fitochimici appropriati forniti come trattamenti in ciascuna gabbia a tazza. I trattamenti consistevano in un controllo (soluzione di zucchero al 20%) e quattro sostanze fitochimiche: caffeina, acido gallico, kaempferolo e acido p- cumarico, a tre concentrazioni somministrate in siringhe per l’alimentazione ( Tabella 1 ). Abbiamo mirato a testare una vasta gamma di concentrazioni da basse concentrazioni rilevanti di nettare a concentrazioni molto alte e potenzialmente tossiche per determinare le risposte che abbracciano queste concentrazioni. Mentre mancano i rapporti sulle concentrazioni di nettare di acido gallico, kaempferolo e acido p- cumarico, gli studi sulla caffeina dimostrano che 25 ppm rientra nell’intervallo naturale e 2500 ppm è superiore alla concentrazione tossica riportata per caffeina. Abbiamo scelto di testare tre concentrazioni: 25 ppm, 250 ppm e 2500 ppm per tutti e quattro i fitochimici. I composti del test sono stati ottenuti da Sigma-Aldrich (St. Paul, MN, USA) ed erano tutti almeno il 97,5% di purezza (kaempferol N. cat. K0133, acido p- cumarico N. cat. C9008, acido gallico No. cat. G7384 , caffeina N. cat. C0750). I composti sono stati sciolti in acqua distillata alla concentrazione desiderata (se necessario a fuoco moderato) e il 20% di saccarosio ( p / v ) è stato quindi miscelato accuratamente nella soluzione. Ogni siringa contenente una concentrazione di un fitochimico miscelata in una soluzione di zucchero acquoso al 20% è stata fornita alle api per nutrire ad libitum . Le soluzioni di alimentazione sono state sostituite ogni 10-12 giorni per mantenere la freschezza. Le gabbie sono state monitorate quotidianamente, sono state registrate la data di mortalità e il numero di api morte e le api morte sono state rimosse.

Tabella 1

Strutture e classificazione dei fitochimici utilizzati per l’integrazione dietetica.

2.2. Saggio di tolleranza agli agenti patogeni

Le spore di Nosema ceranae sono state ottenute dal laboratorio Naug presso la Colorado State University, dove studi precedenti hanno utilizzato PCR multiplex ed elettroforesi per confermare la specie. Le spore si presentavano sotto forma di sospensione macerata del tratto intestinale. La concentrazione iniziale di spore è stata determinata usando un emocitometro. Per generare l’inoculo di spore fresco per questo test, la sospensione di spore miscelata con una soluzione di saccarosio al 50% è stata somministrata alle api da miele che sono state mantenute in gabbia per una settimana. Questa procedura ha dimostrato di essere efficace nel generare una nuova infezione. Sono state estratte budella di api infette e le spore sono state quindi nuovamente sospese in soluzione di saccarosio al 50% per produrre un inoculo di spore con una concentrazione di 1 × 10 ⁵ spore per μL necessarie per alimentare 8 × 10 ⁴ spore per ape. L’inoculo di spore è stato conservato a 4 ° C e utilizzato per l’inoculazione nelle prossime settimane.

Le api sono state mantenute a digiuno per due ore prima della nutrizione individuale con inoculo sperimentale e di controllo. L’alimentazione individuale è stata utilizzata per garantire l’esposizione a una quantità nota di spore e per produrre una minore variazione del livello di infezione tra le api. Le api di otto giorni sono state alimentate forzatamente con 2 µL di inoculo di spore posizionando la goccia di inoculazione contro le parti della bocca dell’ape fino a quando l’intera goccia non è stata consumata. Questo processo viene regolarmente utilizzato per l’infezione artificiale delle api da miele con N. ceranae. Le api alimentate con inoculo di spore sono state trasferite in gabbie a tazza monouso in modo tale che vi fossero dieci api infette per gabbia a tazza. Le gabbie a tazza sono state quindi assegnate in modo casuale a diversi trattamenti fitochimici in modo tale che vi fossero tre gabbie a tazza per trattamento per un totale di 30 api per trattamento ( Tabella 1 ). Tre simili gabbie a tazza con dieci api per gabbia sono state istituite come controlli, per un totale di 30 api infette che ricevono una soluzione di saccarosio al 20%. Le gabbie venivano monitorate quotidianamente per le api morte che venivano rimosse. Il carico di spore in ogni ape morta è stato quantificato su un emocitometro dopo aver omogeneizzato l’intero intestino.

2.3. Analisi statistica

Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando IBM Statistics SPSS 25. Le stime di probabilità di sopravvivenza Kaplan-Meier sono state utilizzate per valutare le differenze nella sopravvivenza delle api da miele tra trattamenti fitochimici e concentrazioni. I test log-rank (Mantel-Cox) sono stati usati per confronti a coppie. I carichi di spore di Nosema sono stati trasformati in tronchi per la normalità prima di completare l’analisi univariata della varianza seguita dai confronti post-hoc di Tukey. La longevità delle api infette nel trattamento integrato fitochimico è stata confrontata dal test Medians.

3. Risultati

3.1. Sopravvivenza

Le api operaie integrate con sostanze fitochimiche alimentari sono sopravvissute più a lungo delle api di controllo ( Figura 1 A) per tutto il 2016 e il 2017 senza effetti significativi di anni. Le concentrazioni più basse di fitochimici nella dieta erano generalmente più benefiche ( Figura 1 B) sebbene gli effetti dei fitochimici sulla longevità variavano con le concentrazioni. La caffeina a 25 ppm presentava la longevità mediana più elevata, l’acido gallico aveva la longevità mediana più elevata a 250 ppm e l’integrazione di kaempferol mostrava la longevità mediana più elevata a 2500 ppm. Nel 2016, gli effetti di diverse concentrazioni differivano l’uno dall’altro ed erano tutti significativamente più alti rispetto al controllo, tuttavia nel 2017 non vi sono stati effetti sulle concentrazioni. I risultati del confronto a coppie tra diverse concentrazioni per ciascuno dei fitochimici sono presentati nel supplemento S1 e S2 . Non vi è stata alcuna prova della differenza nella quantità di sostanze chimiche e concentrazioni consumate dalle api come visto da un test di tolleranza che ha misurato la quantità delle diverse sostanze fitochimiche consumate ( Supplemento S3 e S4 ).

Proporzioni di sopravvivenza ( A ) e longevità mediana ( B ) delle api alimentate ad libitum con soluzioni di saccarosio integrate con sostanze fitochimiche a diverse concentrazioni. Le analisi di sopravvivenza Kaplan Maier e il log-rank (Mantel-Cox) sono stati utilizzati confronti a coppie per confrontare i tassi di sopravvivenza tra controllo e diverse concentrazioni all’interno di ciascun composto fitochimico ( p <0,0001 è indicato ***; p = 0,01 è indicato da *; p > 0,5 è indicato da ns; i numeri indicano le dimensioni del campione (sopra le barre di trattamento e sotto ● rispettivamente) I confronti a coppie tra composti e dosi sono forniti nel supplemento S1.

3.2. Tolleranza ai patogeni

La supplementazione fitochimica nella dieta delle api infette da N. ceranae ha avuto un effetto significativo sul carico di spore alla mortalità. I risultati di GLM Univariate ANOVA hanno indicato significativi effetti diretti di sostanze fitochimiche e concentrazioni, nessun effetto colonia rilevabile e un significativo effetto di interazione tra fitochimica e concentrazioni ( Tabella 2 ). Confronti post-hoc hanno indicato che caffeina, kaempferol e acido p- cumarico hanno ridotto significativamente i carichi di spore rispetto ai controlli infetti ( Figura 2 A) e che una bassa concentrazione (25 ppm) è risultata più efficace nel ridurre i carichi di spore ( Figura 2 A ). Il confronto della longevità mediana con il test Medians ha indicato un aumento significativo della longevità delle api infette integrate con caffeina, acido gallico e kaempferol a concentrazioni basse (25 ppm) e medie (250 ppm) ( Figura 2 B; Supplemento S5 ). Mentre l’acido p- cumarico e il kaempferolo hanno aumentato significativamente la longevità in tutte le concentrazioni rispetto alla longevità delle api di controllo infette, gli altri fitochimici testati hanno aumentato la longevità solo a concentrazioni più basse.

Carichi di spore (valori non trasformati) nelle api infette morte ( A ) e longevità mediana delle api ( B ) che hanno ricevuto l’integrazione dietetica di fitochimici a diverse concentrazioni (N = 30 api per ciascun trattamento fitochimico; N = 22 per il controllo). Le barre con lettere diverse sono significativamente diverse dal controllo (Carichi di spore ( A ): GLM Univariate ANOVA seguito dal confronto post-hoc di Tukey dei carichi di spore trasformati in tronchi; Longevità ( B ): test mediano).

Tavolo 2

GLM Analisi univariata del carico di spore di N. ceranae nelle api operaie con integrazione dietetica di fitochimici a diverse concentrazioni. Le celle in grassetto indicano un significato.

4. Discussione

In questo studio, abbiamo dimostrato che i fitochimici hanno promosso la longevità delle api operaie e la tolleranza ai patogeni. Precedenti studi hanno riportato un analogo aumento della longevità con diete integrate individualmente con acido p- cumarico, quercetina e caffeina, ma mancano studi simili che esplorano gli effetti dell’acido gallico e del kaempferol. Mentre le risposte relative alla concentrazione erano evidenti nella caffeina, nell’acido gallico e nel kaempferol, le concentrazioni generalmente più basse erano più efficaci sia nel promuovere la tolleranza ai patogeni che nell’aumentare la longevità. I fitochimici sono metaboliti secondari delle piante che agiscono come tossine e deterrenti proteggendo le piante da parassiti e agenti patogeni. Le api da miele consumano una quantità sostanziale di questi composti secondari contenuti nel polline, nel nettare, nel miele e nel pane delle api immagazzinati nelle colonie. Gli studi a sostegno della forza della benefica coevoluzione nei tratti chimici floreali e negli impollinatori sono limitati, ma una crescente evidenza indica la tolleranza ai composti naturali presenti nel nettare. In altri studi, le concentrazioni fitochimiche che mostrano benefici sono risultate simili alle concentrazioni naturali nel nettare floreale. Composti nel miele, come l’acido cumarico e altri acidi fenolici, simili a quelli riportati nel nostro studio migliorano la longevità e aumentano la concentrazione degli enzimi disintossicanti e flavonoli, come la quercetina influenzano la longevità e aumentano la tolleranza ad alcuni pesticidi. I nostri risultati aggiungono ulteriori prove a questo campo in crescita a sostegno dell’idea che i composti di difesa delle piante apportino benefici alle api da miele.

Gli impollinatori di insetti, in particolare quelli che ricevono basse concentrazioni, potrebbero sviluppare tolleranza quando gli effetti di tossicità sono lievi. La caffeina, nei nostri studi, ha aumentato la longevità a 25 e 250 ppm ma ha ridotto la longevità al di sotto di quella del controllo ad un’alta concentrazione di 2500 ppm. È stato dimostrato che la caffeina a basse concentrazioni aumenta la longevità, limita l’infezione da Nosema spp., Diminuisce le tendenze metaboliche legate all’età e diminuisce i livelli di metilazione del DNA nelle api più anziane, supportando la raccomandazione dell’uso della caffeina per la resistenza allo stress nelle colonie di api. Sono stati dimostrati benefici di bassi livelli di caffeina in saccarosio sull’apprendimento e sulla ritenzione, in cui la caffeina ha un forte effetto sulla memoria a lungo termine, ma un effetto debole sulla velocità di apprendimento. Inoltre, le api nello studio avevano maggiori probabilità di rifiutare il saccarosio con caffeina a concentrazioni più elevate. I nostri test di tolleranza, tuttavia, non hanno mostrato differenze nella quantità di sostanze fitochimiche consumate in una data durata per le concentrazioni che abbiamo testato, suggerendo che non vi sono prove di preferenza tra le diverse concentrazioni nel nostro studio. Essere in grado di respingere soluzioni di saccarosio con elevate concentrazioni di caffeina è stato suggerito come meccanismo per guidare la selezione verso concentrazioni floreali di caffeina non repellenti ma farmacologicamente attive. I nostri risultati suggeriscono che l’effetto dannoso della riduzione della longevità dal consumo di 2500 ppm (alta concentrazione) di caffeina potrebbe essere potenzialmente il fattore selettivo per la capacità di apprendimento nelle api di evitare fiori con caffeina elevata, mentre l’aumento della longevità a basse e medie concentrazioni può svolgono un ruolo importante nel mantenimento delle concentrazioni farmacologicamente attive della caffeina nel nettare promuovendo l’apprendimento e la memoria. Sono necessari ulteriori studi per valutare le concentrazioni di nettare di fitochimici per confermare questa ipotesi. Attualmente mancano studi simili sugli effetti degli altri fitochimici testati nel nostro studio sull’apprendimento e la memoria delle api.

L’integrazione dietetica con caffeina, kaempferolo e acido p- cumarico a 25 ppm ha ridotto significativamente il carico di spore nelle api infette. Kaempferol ha ridotto il carico di spore a tutte le concentrazioni mentre la caffeina non è risultata utile a concentrazioni più elevate. L’effetto dannoso dell’alta concentrazione di caffeina è stato più evidente nelle api infette, come si vede dalla ridotta longevità delle api infette, integrata con caffeina da 2500 ppm. Le api infette integrate con sostanze fitochimiche nella loro dieta vivevano più a lungo delle api di controllo infette. Le api di controllo nel test di sopravvivenza che erano sane, hanno mostrato una longevità mediana di 20 giorni rispetto a quella di 12 giorni nelle api di controllo infette. Questa riduzione della longevità delle api di controllo infette è prevedibile, ma l’integrazione fitochimica ha aumentato la longevità delle api infette a 23 giorni (caffeina 250 ppm), leggermente superiore anche alle api sane. Mentre è possibile che le spore di N. ceranae possano essersi spostate tra le api attraverso la tropalassi, è improbabile che abbia influenzato solo il conteggio finale delle spore nelle api morte poiché anche i fitochimici nella dieta sarebbero condivisi durante il processo. L’integrazione fitochimica ha continuato a mostrare un aumento della longevità, ma un tale aumento insieme all’osservazione che le api infette che ricevono un’integrazione fitochimica presentavano bassi carichi di spore di N. ceranae , pone un interessante enigma sul fatto che l’infezione con accesso a sostanze fitochimiche a basse concentrazioni possa rappresentare un rischio di aumento della trasmissione delle spore. Gli studi hanno dimostrato che le api infette da N. ceranae che soffrono anche di fame hanno probabilità molto alte di presentare un foraggiamento più elevato e rischioso. Tuttavia, se le api accedono a sostanze fitochimiche mentre consumano nettare floreale, il rischio di morire di fame è ridotto al minimo, il che potrebbe quindi ridurre la probabilità di foraggiamento da parte delle api infette. Ciò ribadisce l’importanza delle fonti floreali di nettare che forniscono alle api un completo complemento di composti dietetici e soddisfano le esigenze energetiche, promuovendo la capacità delle api di affrontare l’infezione da patogeni e ridurre al minimo la diffusione di agenti patogeni ad altri alveari.

Di seguito sono disponibili online all’indirizzo http://www.mdpi.com/2075-4450/10/1/14/s1 , Figura S1: dieta media consumata per ciascuno dei trattamenti fitochimici e le soluzioni di controllo. Figura S2: proporzioni di sopravvivenza delle api infettate con spore di Nosema ceranae e quindi alimentate ad libitum con soluzioni di saccarosio integrate con sostanze fitochimiche a diverse concentrazioni. Le analisi di sopravvivenza Kaplan Maier sono state utilizzate per confrontare i tassi di sopravvivenza. Tabella S1: l’effetto sulla longevità provocato da diverse concentrazioni dello stesso fitochimico. Analisi di sopravvivenza di Kaplan-Maier seguite da confronti di Log rank (Mantel Cox), Tabella S2: L’effetto sulla longevità provocato da diversi fitochimici a concentrazioni simili (Conc.) Analisi di sopravvivenza di Kaplan-Maier seguite da confronti di Log rank (Mantel Cox). Metodi S1: test di tolleranza per misurare la quantità di sostanze fitochimiche consumate dalle api.

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